依待測物分的比色皿光程：以濃度為基礎的選型矩陣

選比色皿光程是例行 UV-Vis 分光光度法裡影響最大的決定，不該用猜的。朗伯-比爾定律—— A = ε · c · l ——告訴你吸光度與濃度 c 與光程 l都成線性。如果你改不了莫耳吸光係數 ε （它是你待測物在所選波長的性質）、又不想稀釋樣品，那光程就是你實際在選的變數。

本指南把選型問題簡化成「逐待測物」的答案。對涵蓋多數實驗室 UV-Vis 工作的八個待測物類別——蛋白質、核酸、酵素輔因子、色素與染料、發酵液、過渡金屬比色化學、石油產品與環境水樣——我們列出你會遇到的典型濃度範圍、目標吸光度窗口，以及讓你落在任何現代分光光度計線性偵測甜蜜點的光程。本頁以「為何螢光選型不同」的說明收尾，並連到我們的 朗伯-比爾光程計算器 ，供你想輸入自己具體數字的情況。

1. 0.1–1.0 AU 法則 — 你瞄準的甜蜜點

現代 UV-Vis 分光光度計在約 0.1 到 1.0 AU。1.0 AU 以上光度雜訊增加（你在量兩個小強度之間的小差異）；2.0 AU 以上多數儀器飽和、偵測器無法把透射強度與背景區分。0.1 AU 以下，低訊號量測的相對雜訊降低精度（0.05 AU 峰上 0.001 AU 的漂移是 2% 誤差）。甜蜜點是 0.2–0.8 AU；可用範圍是 0.1–1.0 AU。

對任何給定的樣品，三件事決定你落在吸光度尺度的哪裡：

1. 此 莫耳吸光係數 待測物在所選波長的 ε——分子的性質、不在你控制之內。
2. 此 濃度 c 待測物的——你可透過稀釋控制，但稀釋增加誤差、消耗樣品。
3. 此 光程 l 比色皿的——你可透過選不同的比色皿控制。

如果你不想稀釋（珍貴樣品、繁瑣的稀釋系列，或你需要為下游工作保留原濃度），光程就是你唯一在選的變數。本頁其餘章節逐待測物類別給你那個決定。

DNA / 蛋白質

C104CS99——10 mm 超微量

200 µL · 遮罩孔徑 · A260 核酸與 A280 蛋白質的主力

查看微量比色皿 →

OD600 / 比色

20 mm 標準比色皿

7 mL · 雙面透光 · 供發酵 OD600、Bradford / Lowry / BCA、過渡金屬比色

查看標準比色皿 →

微量水品管

C502CA5——50 mm 長光程

17.5 mL · 相較 10 mm 5× 靈敏度 · 供微量硝酸鹽 / 磷酸鹽 / 氯 / 製藥雜質

長光程指南 →

2. 快查矩陣

找你的待測物類別。橫讀到建議光程與多數分析人員用的波長。如果你的濃度落在典型範圍的邊緣，參考下面的專屬章節了解往上或往下調的指引。

中間欄（「建議光程」）是典型濃度的單一最佳選擇。當你的樣品落在典型範圍邊緣時，用右邊兩欄。多光程工作流程（為同一樣品平行跑 1、5、10 mm 比色皿）涵蓋在 如何選 UV-Vis 比色皿光程.

3. 蛋白質 — A280、BCA、Bradford、Lowry

蛋白質定量有兩種需要不同光程的不同情況。

直接 A280 吸光度

芳香族胺基酸（色胺酸、酪胺酸，以及較少的苯丙胺酸）在 280 nm 吸收，典型混合蛋白質的有效莫耳吸光係數約 1.0–1.5 (mg/mL)⁻¹ cm⁻¹。在 1 mg/mL、 10 mm 比色皿裡，A280 落在約 1.0 AU——正好在線性窗口的邊緣。

• 0.05–0.5 mg/mL： 用一個 10 mm 比色皿。
• 0.5–5 mg/mL： 用一個 1 mm 比色皿——多數實驗室蛋白質的主力選擇。
• 5–50 mg/mL （濃抗體或重組蛋白質母液）：用一個 0.1 mm 或 0.5 mm 比色皿，或可拆卸薄膜座。
• 50 mg/mL 以上： 稀釋，或在一個 0.05 mm 可拆卸比色皿裡量。

比色測定（Bradford、Lowry、BCA）

Bradford 在 595 nm 讀取（考馬斯亮藍 G-250 染料結合）、Lowry 在 750 nm（鹼性銅-蛋白質-Folin）、BCA 在 562 nm（雙喹啉甲酸銅還原）。三者都對 BSA 或 IgG 標準曲線校正、目標工作範圍 0.1–1.5 mg/mL。

• 標準 10 mm 比色皿 是已發表方法的預設、也是幾乎所有比色蛋白質工作的對的選擇。
• 對 微量盤 格式（96 孔），200 µL 孔體積下有效光程是 5–6 mm；校正曲線必須重做，因為光程與比色皿工作不同。

4. 核酸 — A260 的 DNA 與 RNA

核酸在 260 nm 吸收，雙股 DNA 的有效消光係數約 50 (µg/mL)⁻¹ cm⁻¹、單股 DNA 40、RNA 33。在 50 ng/µL dsDNA、 10 mm 比色皿裡，A260 = 1.0 AU——對多數基因體製備濃度都讓線性窗口飽和。

• 稀 DNA < 20 ng/µL： 用一個 10 mm 比色皿。定序製備稀釋常用。
• 標準基因體製備，50–500 ng/µL： 用一個 1 mm 比色皿。這是多數分子生物學所在之處。
• 濃母液，500–3,000 ng/µL： 用一個 0.1 mm 或 0.5 mm 比色皿。
• 質體製備超過 3,000 ng/µL： 先稀釋、再用 1 mm 讀；或用微量底座（見 比色皿 vs NanoDrop 比較，即將推出）。

純度比 A260/A280 與 A260/A230

純度比與光程無關——分子與分母都隨 l 縮放——所以任何選得好的光程都給出同樣的比值。例外：在非常低的吸光度（任一波長 < 0.1 AU）下，比值變得不可靠，因為儀器雜訊主宰較低吸光度的讀數。如果你的 A260 低於 0.1，換更長的比色皿，讓比值計算有訊號可用。

5. 酵素與輔因子測定 — NADH、NADPH、NAD⁺、NADP⁺

NADH 與 NADPH 在 340 nm 吸收、消光係數 6,220 M⁻¹ cm⁻¹。在 100 µM NADH、 10 mm 比色皿裡，A340 ≈ 0.62 AU——舒適地落在窗口中段。NAD⁺ 與 NADP⁺（氧化態）在 340 nm 不吸收；340 nm 帶的出現與消失是多數 NAD 依賴脫氫酶測定的讀出。

• 10–500 µM NADH 的標準動力學測定： 用一個 10 mm 比色皿。蘋果酸、乳酸、麩胺酸、酒精脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶與多數臨床化學方法的預設。
• 微量級動力學 < 5 µM NADH： 用一個 50 mm 比色皿，或換螢光偵測（NADH 在 340 nm 激發下於 460 nm 發螢光，靈敏度比吸光度高得多）。
• 1 mM NADH 以上： 先稀釋，或用一個 1–5 mm 比色皿。

對控溫酵素動力學， 螺旋蓋密封比色皿 減少 30+ 分鐘動力學運行中的蒸發、並與恆溫 Peltier 座乾淨搭配。

6. 色素與染料 — 可見光範圍發色團

天然與合成發色團的消光係數範圍很廣。葉綠素 a 在 664 nm 有 ε ≈ 76,000 M⁻¹ cm⁻¹（非常強）；甲基橙在 464 nm 有 ε ≈ 27,000 M⁻¹ cm⁻¹；食用染料常落在約 10,000–30,000 M⁻¹ cm⁻¹。

• 標準 10 mm 供 0.1–100 µM 範圍的分析工作——涵蓋多數染料化學、食品色、飲料色與稀釋後的葉綠素萃取液。
• 1–5 mm 供濃母液染料溶液，或工作溶液就是生產濃度的製程中色度品管。
• 50 mm 供微量染料汙染工作（廢水中殘留染料、脫色效率、環境染料痕量）。

可見光 vs 紫外比色皿

色素與染料工作絕大多數在可見光（400–700 nm），此處標準 JGS2 石英、光學玻璃、甚至拋棄式塑膠比色皿全都透明。除非你的方法也讀 220 nm 以下，否則不需要 JGS1 深紫外等級。見我們的 紫外截止指南 了解取捨。

7. 發酵與細胞培養 — OD600

600 nm 的光密度是濁度量測、不是真正的吸光度——它量的是細胞的前向散射。朗伯-比爾線性在 10 mm 比色皿裡約維持到 OD600 ≈ 0.6–0.8，之後因多重散射而偏離。為了可比的歷史數字，慣例是把濃培養物稀釋回 10 mm 比色皿的線性窗口。

• 10 mm 比色皿是已發表方法的預設 供大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞懸浮液與多數發酵工作。所有已發表的生長曲線與 OD-對-CFU 校正都假設 10 mm 光程。
• 濃培養物 > OD 1.0 時，在生長培養基裡稀釋 1:5 或 1:10、再用 10 mm 比色皿讀。別禁不住誘惑為濃培養物換 1 mm 比色皿——你會得到一個數字，但它不會與已發表的生長曲線吻合，而且多重散射偏差會以非平凡的方式隨細胞濃度縮放。
• 連續線上監測時，5 mm 或 10 mm 有效光程的線上透射探頭不必取樣就給出即時 OD。

8. 過渡金屬比色化學

經典濕式化學方法——過錳酸鹽、重鉻酸鹽、鐵配菲咯啉、銅配新銅試劑、錳配過碘酸鹽、氨配奈斯勒——全都形成消光係數在 4,000–30,000 M⁻¹ cm⁻¹ 範圍的有色錯合物、瞄準 500–700 nm 可見光窗口。

• 標準 10 mm 比色皿 對多數已發表方法涵蓋 0.1–100 mg/L 的待測物。Standard Methods、ASTM 與 EPA 協定除非另有明文，否則都假設 10 mm 光程。
• 1 mm 比色皿 供濃製程樣品（電鍍槽品管、高濃度工業廢水）。
• 50 mm 比色皿 供 µg/L 級的微量金屬——常用於法規限值遠低於 1 mg/L 的環境水分析與超純水品管。

顯色時間

許多過渡金屬方法需要固定的顯色時間（依方法 5、15、30 分鐘）。所有標準品與樣品都在加試劑後同樣的經過時間讀取。光程不改變顯色的動力學；它只決定哪個濃度帶落在你的吸光度窗口。

9. 石油產品 — API 色度、Saybolt、ASTM 色度

石油色度是法規與面向客戶的規格、不是定量的吸光度數字。三個方法標準居主導：

• ASTM D1500（520 nm）： 深色石油產品（潤滑油、燃料油、殘餘燃料）。用 33-mm 光程比色皿對辛烷標準。
• ASTM D156 / Saybolt（540 nm）： 淺色產品（煤油、石腦油、白油）。用 50-mm 或 100-mm 光程比色皿。
• ASTM D6045（525 nm）： 在 10-mm 比色皿裡將 D1500 與 D156 分光光度自動化，煉油廠的色度計用。

這裡的光程是方法定義的、不是分析人員選的。用配你方法標準或你色度計製造商校正的比色皿長度。相關的問題是比色皿材質（光程之外）對不對：ASTM 石油方法對所用的色度波長接受光學玻璃與石英互換。

10. 環境水分析 — 微量 UV-Vis

水中的微量無機與有機待測物落在 µg/L 到 mg/L 範圍，遠低於發酵或製藥工作的典型濃度。已發表的 EPA 與 Standard Methods 協定用長光程比色皿有兩個理由：濃度低、以及許多相關待測物的莫耳吸光係數低。

• 游離氯（DPD 法，530 nm）： 0.05–5 mg/L 用 10 mm 比色皿； 0.005–0.5 mg/L 用 50 mm 比色皿。100 mm 比色皿把工作範圍降到個位數 µg/L，供超純水品管。
• 硝酸鹽（紫外 220 nm 或鎘還原 540 nm）： 50 mm 比色皿標準 供飲用水（0.1–10 mg/L NO₃-N）；源水痕量用 100 mm。
• 磷酸鹽（鉬藍，880 nm）： 0.1–10 mg/L 用 10 mm 比色皿； 10 µg/L–1 mg/L 用 50 mm 比色皿；環境痕量用 100 mm。
• 亞硝酸鹽（Griess 反應，540 nm）： 10 mm 比色皿標準 在 0.01–1 mg/L；微量用 50 mm。
• 鐵（菲咯啉，510 nm）： 0.1–5 mg/L 用 10 mm。

用於微量水工作的 50 mm 與 100 mm 比色皿本身是一個重要的商業利基——涵蓋在我們即將推出的「微量 UV-Vis 分析用長光程比色皿」指南。它們用與標準 10 mm 比色皿相同的 JGS 級石英與相同的製造規範，只是外尺寸更長。

11. 螢光是不同的問題

上面的光程分析適用於吸光度光譜。對螢光，幾何改變了分析：

• 此 激發路徑 進來時穿過比色皿一次。光程對激發吸收有影響，但只是微弱的——螢光計通常用固定的 10 mm 比色皿、接受那是多少激發光程就多少。
• 此 發射收集路徑 離激發 90 度，是限制靈敏度的東西。比色皿的幾何（四面全拋光的 10x10x10 mm 方形，或低體積樣品的短孔徑）比光程本身更重要。
• 內滤效應 ——待測物本身對發射螢光的再吸收——在 10 mm 比色皿裡激發波長的吸光度超過約 0.05 AU 時變得顯著。超過這個濃度，螢光強度就不再與濃度成線性。解法是稀釋（保留比色皿選擇）或用更短光程的螢光比色皿。

螢光比色皿幾何、拋光要求與內滤管理的完整處理，見我們的 螢光比色皿指南.

12. 依光程分的工具與現貨 SKU

數值工作時，把你具體的濃度、消光係數與目標吸光度輸入計算器，讓它回傳對的光程。採購時，跳到尺寸表、依外尺寸選。

13. 常見問題

14. 免責聲明與註記