Espectrofotometría UV-Vis: teoría, instrumentos y selección de cubetas
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La espectrofotometría UV-Vis es la medición cuantitativa de cuánta luz ultravioleta y visible (190–800 nm) absorbe una muestra; se usa en el control de calidad farmacéutico, la bioquímica, la monitorización ambiental, el análisis de alimentos y la ciencia de materiales. El método se basa en la ley de Beer-Lambert (A = ε · c · L), donde la absorbancia es proporcional a la concentración del analito y al paso de luz. Los instrumentos modernos alcanzan una resolución de 0.001 AU, una exactitud de longitud de onda de ±0.5 nm y < 0.01% stray light across a 5–6 log dynamic range.
Espectrofotometría UV-Vis: guía completa de teoría, instrumentos y selección de cubetas
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MachinedQuartz · Guía práctica
Espectrofotometría UV-Vis: teoría, instrumentos y selección de cubetas
Una guía práctica: cómo funciona el UV-Vis, las cuentas de Beer-Lambert que de verdad usa en el banco, el material de cubeta que encaja con su longitud de onda y un árbol de resolución de problemas en cinco pasos para cuando el espectro sale mal, escrita desde el banco de un fabricante de cuarzo.
10 secciones
3 tablas de referencia
árbol de resolución de problemas en 5 pasos
FAQ de 8 preguntas
Sección 1
¿Qué es la espectrofotometría UV-Vis?
La espectrofotometría UV-Vis (también escrita UV/Vis o espectroscopía ultravioleta-visible) es una técnica de medición cuantitativa que determina cuánta luz absorbe una muestra en el rango de 190–1100 nm.
La espectrofotometría UV-Vis es una técnica analítica que mide cuánta luz ultravioleta y visible absorbe una muestra en cada longitud de onda. El patrón de absorción indica qué hay en la muestra y en qué cantidad.
La técnica divide el rango de luz en dos regiones. La región ultravioleta va de unos 190 a 380 nm. La región visible va de 380 a 780 nm. Un instrumento moderno suele barrer ambas regiones en una sola pasada, y a menudo se extiende hasta el infrarrojo cercano, hasta 1100 nm o más.
El UV-Vis es uno de los métodos más usados en química analítica por tres razones: es rápido (un barrido completo dura segundos), no es destructivo (se puede recuperar la muestra) y funciona con una amplia variedad de materiales: soluciones acuosas, solventes orgánicos, películas finas y, con el accesorio adecuado, sólidos y gases.
Lectura rápida: UV-Vis = entra luz, sale luz, haga las cuentas. El instrumento mide la absorbancia; Beer-Lambert la convierte en concentración. Todo lo demás en esta guía explica cómo hacer que esas cuentas funcionen de verdad.
Sección 2
Cómo funciona el UV-Vis — el principio
Cuando la luz UV o visible incide en una molécula, un fotón solo se absorbe si su energía coincide con el salto entre dos niveles de energía electrónicos de esa molécula. El fotón absorbido promueve un electrón del estado fundamental a un estado de mayor energía. Los fotones cuya energía no coincide con ningún salto electrónico pasan sin alterarse.
El resultado, registrado como un espectro, es una huella de la estructura electrónica de la molécula. Tres tipos de transición explican casi todas las bandas que verá en el UV-Vis rutinario:
- π → π* en sistemas conjugados (alquenos, anillos aromáticos, colorantes). Bandas intensas y anchas, normalmente entre 200 y 400 nm.
- n → π* en moléculas con pares de electrones libres adyacentes a sistemas π (carbonilos, grupos nitro). Bandas más débiles, a menudo a mayor longitud de onda que las π → π*.
- d–d transiciones en complejos de metales de transición. Responsables del color visible de la mayoría de las soluciones de complejos metálicos.
El instrumento registra la razón entre la intensidad de luz antes de la muestra (I₀) y la intensidad después de ella (I). De esa razón se derivan dos números: transmitancia (T = I/I₀, a veces expresada como %T) y absorbancia (A = log₁₀(I₀/I)). El trabajo cuantitativo siempre usa la absorbancia porque escala linealmente con la concentración en el rango correcto; esa es la ley de Beer-Lambert de la sección 3.
Leer un espectro UV-Vis: λmax, forma del pico y qué le dicen
Toda banda de absorción tiene una longitud de onda de absorbancia máxima, llamada λmax. La posición de λmax identifica el cromóforo (desplazamiento al rojo = sistema conjugado más grande; desplazamiento al azul = sustituyente atractor de electrones). La altura en λmax da la señal analítica que introduce en Beer-Lambert. La forma también lleva información: un único pico agudo sugiere una sola especie; los hombros o picos desdoblados apuntan a estructura fina vibracional o a una mezcla; los puntos isosbésticos (lugares donde dos espectros se cruzan a absorbancia constante) confirman un equilibrio limpio de dos componentes.
Sección 3
La ley de Beer-Lambert
Toda medición UV-Vis cuantitativa se reduce a una ecuación:
A = ε · c · l
- A — absorbancia, adimensional, leída directamente del instrumento.
- ε (épsilon) — coeficiente de absorción molar, en M⁻¹·cm⁻¹. Una propiedad del analito a una longitud de onda dada; se consulta o se mide una vez con una curva de calibración.
- l — paso de luz de la cubeta, en cm. El estándar es 1 cm, pero se usa de forma rutinaria cualquier valor de 0.01 cm a 10 cm.
- c — concentración del absorbente, en mol·L⁻¹ (molar).
Un ejemplo resuelto
Suponga que mide A = 0.43 a 260 nm en una cubeta de 1 cm y sabe que ε para su analito a 260 nm es 14 200 M⁻¹·cm⁻¹. Despejando Beer-Lambert:
c = A / (ε · l) = 0.43 / (14 200 · 1) = 3.03 × 10⁻⁵ M = 30.3 µM
La ventana de absorbancia de 0.2 a 1.0
Beer-Lambert es lineal solo en un rango de trabajo, normalmente A = 0.2 a 1.0 para la mayoría de los instrumentos (véase el tratamiento de la ley en IUPAC y Chemistry LibreTexts ). Los textos antiguos citan 0.2–0.5; los detectores modernos de matriz de fotodiodos se mantienen lineales hasta cerca de 1.0 y a veces más. Por debajo de 0.2, el ruido del detector domina la señal. Por encima de 1.0 entran en juego tres cosas: la luz dispersa, la no linealidad del detector y los efectos químicos (agregación, cambios de índice de refracción). La solución cuando A es demasiado alta o baja es casi siempre una de dos: diluir la muestra o cambiar el paso de luz.
¿Necesita cambiar el paso de luz sin rehacer las cuentas? Nuestra calculadora de paso de luz convierte la absorbancia entre dos cubetas cualesquiera, para que sepa exactamente qué cubeta coger.
Cuándo falla Beer-Lambert
Las desviaciones de la linealidad tienen un pequeño grupo de sospechosos habituales:
- Concentración alta (typically > 0.01 M) — las moléculas de analito interactúan, y la propia ε empieza a depender de c.
- Dispersión — las muestras turbias, las partículas en suspensión o las muestras biológicas sin filtrar elevan la absorbancia aparente a todas las longitudes de onda. Filtre, centrifugue o corrija con una resta de línea base.
- Luz policromática — un ancho de banda instrumental amplio en una zona pronunciada del espectro da una respuesta no lineal. Estreche la rendija si su instrumento lo permite.
- Luz dispersa — luz que llega al detector sin haber pasado por el monocromador; se trata en la sección 7.
Sección 4
Por dentro de un espectrofotómetro UV-Vis
Un espectrofotómetro UV-Vis tiene cuatro bloques funcionales: una fuente de luz, un selector de longitud de onda (monocromador o matriz), un compartimento de muestra y un detector. Todo instrumento comercial es una variación de ese patrón.
4.1 Fuente de luz
| Fuente | Rango útil | Dónde se encuentra |
|---|---|---|
| Lámpara de arco de deuterio | 190–400 nm | La lámpara UV de todo instrumento de grado de investigación |
| Tungsteno-halógeno | 320–2,500 nm | La lámpara visible/NIR; emparejada con el deuterio |
| Arco / flash de xenón | 190–2,000 nm | Instrumentos compactos de fuente única y de matriz |
| LED | Bandas discretas en todo el UV-Vis | Instrumentos compactos, portátiles y de campo |
4.2 Monocromador
El monocromador elige una longitud de onda de la amplia salida de la lámpara. Tiene tres partes: una rendija de entrada, un elemento dispersor (casi siempre una red de difracción holográfica; los instrumentos antiguos usan un prisma) y una rendija de salida. Al girar la red se barren las longitudes de onda. El ancho de la rendija fija el ancho de banda espectral — rendija más estrecha = picos más nítidos pero menos señal. Las redes holográficas modernas tienen mucha menos luz dispersa que las antiguas redes grabadas mecánicamente, y los diseños de doble monocromador ponen dos en serie para bajar la luz dispersa por debajo del 0.0001%.
4.3 Compartimento de muestra
Aquí es donde va la cubeta. La mayoría de los instrumentos de sobremesa sostienen una sola cubeta de 10 mm a una altura de haz Z de 8.5 o 15 mm, con torretas multicubeta y portacubetas termostatizados por Peltier como accesorios. Para muestras que no van en cubeta, el mismo compartimento admite cubetas de flujo, placas montadas, sondas de inmersión de fibra óptica o esferas integradoras para sólidos y películas.
4.4 Detector
Dominan cuatro tecnologías de detector. Los tubos fotomultiplicadores (PMT) son la opción de alta sensibilidad para el trabajo UV con poca luz. Los fotodiodos de silicio son el caballo de batalla: baratos, duraderos y suficientes para casi todo en el UV-Vis rutinario. Las matrices de fotodiodos (PDA) leen todas las longitudes de onda a la vez en decenas de milisegundos, por eso los instrumentos rápidos de matriz de diodos barren un espectro completo en <1 second. CCDs se comportan de forma similar a las PDA con un mayor número de píxeles.
4.5 Haz simple frente a doble haz frente a matriz
| Configuración | Cómo gestiona el blanco | Ideal para |
|---|---|---|
| Haz simple | Mide el blanco y luego la muestra, de forma secuencial | Análisis rutinario con lámpara estable y pocas longitudes de onda |
| Doble haz | Divide el haz entre blanco y muestra en tiempo real | Barridos largos, cinéticas, trabajo propenso a la deriva |
| Matriz de diodos (haz simple rápido) | Registra el espectro completo en un pulso; el blanco se toma justo antes | Detección por HPLC, cinéticas, laboratorios de alto rendimiento |
Sección 5
Preparación de muestra y selección de cubeta
La cubeta forma parte del camino óptico, no es solo un recipiente. Elija el material equivocado y pierde su corte UV. Elija el paso de luz equivocado y pelea contra Beer-Lambert. Elija una cubeta que no coincida con la altura de haz del instrumento y sus números varían entre instrumentos. La mayoría de las guías pilar despachan esto en un párrafo; aquí está la versión práctica. Para una decisión de compra paso a paso, nuestra guía de selección de cubetas cubre el mismo terreno desde otro ángulo.
5.1 Material de la cubeta frente al corte espectral
La propiedad más importante de una cubeta es el rango de longitudes de onda en el que es transparente. Por debajo del corte, la cubeta absorbe más que la muestra, y la medición carece de sentido.
| Material | Rango útil | Ideal para | Evitar |
|---|---|---|---|
| Cuarzo UV (JGS2) | 190 – 2,500 nm | Trabajo estándar UV + Vis + NIR; la opción por defecto del laboratorio | Por defecto |
| Cuarzo de UV profundo / VUV (JGS1) | 185 – 2,500 nm | Por debajo de 200 nm, validación UV-C, fotolitografía | Mayor coste |
| Cuarzo IR (JGS3) | 260 – 3,500 nm | Trabajo NIR / IR, cinéticas con calentamiento | Sin UV <260 nm |
| Vidrio óptico (BK7) | 340 – 2,500 nm | Trabajo rutinario solo en visible, laboratorios docentes | Sin UV <340 nm |
| Poliestireno / PMMA | ~340 – 800 nm | Trabajo desechable en rango visible, ensayos biológicos | Sin UV, sin solventes |
| Zafiro | ~150 – 5,500 nm | Alta temperatura, alta presión, química agresiva | Coste |
| Fluoruro de calcio (CaF₂) | ~130 – 8,000 nm | UV profundo, cubetas acopladas a FTIR, cubetas de flujo para HPLC | Ligera solubilidad en agua |
Los grados JGS1, JGS2 y JGS3 son las designaciones estándar de sílice fundida óptica de uso generalizado en el sector: el JGS1 es totalmente sintético, con un contenido de iones metálicos extremadamente bajo para la transmisión en UV profundo; el JGS2 es el grado UV estándar; y el JGS3 está optimizado para IR. El método de fabricación también importa — una cubeta Standard 80 ensamblada con adhesivo está bien para trabajo acuoso, pero las cubetas Sintered 80 o Molded 83 son necesarias para solventes, ácidos o temperaturas por encima de 80 °C.
5.2 Paso de luz: cuándo 10 mm no es lo correcto
La cubeta de 10 mm es un valor por defecto, no una ley. Elija el paso de luz para situar su absorbancia en la ventana lineal de 0.2–1.0. Para el árbol de decisión cuantitativo completo, el presupuesto de absorbancia del solvente a paso largo y el protocolo de verificación del paso de luz, vea nuestro análisis a fondo sobre cómo elegir el paso de luz de una cubeta UV-Vis.
| Tipo de muestra | Paso de luz típico | Por qué |
|---|---|---|
| Muestras concentradas (colorantes muy absorbentes, ADN sin diluir) | 1, 2 o 5 mm | Reduce A al rango lineal sin diluir |
| Trabajo cuantitativo rutinario | 10 mm | El estándar de referencia; los valores de ε están tabulados para 1 cm |
| Muestras diluidas, análisis de trazas, nitratos en agua potable | 50 mm o 100 mm | Multiplica A por 5× o 10× para sacar las señales débiles del ruido |
| Muestras a escala de µL | De submm a 1 mm (microcubetas) | Limitado por la geometría; admite volúmenes de 250–1000 µL |
Convierta entre pasos de luz en dos clics: la calculadora de tamaño de cubeta encuentra la cubeta que sitúa su A en la ventana lineal. Para las dimensiones completas de cada formato estándar, consulte la tabla de tamaños de cubetas y celdas.
5.3 Altura de ventana (dimensión Z) y compatibilidad con el instrumento
La dimensión Z es la altura desde el fondo de la cubeta hasta el centro del haz óptico. La mayoría de los instrumentos de sobremesa usan 8.5 mm, 15 mm o 20 mm. Use una cubeta con la Z equivocada y el haz o bien no llega a la cámara de muestra (Z baja) o golpea la pared de la cubeta (Z alta). Tras fabricar miles de cubetas submicro, podemos decirle que la especificación que los clientes OEM más olvidan enviar es la dimensión Z, no el paso de luz, ni el volumen, ni el material. Acertar con la Z es la causa más común de que una medición falle al primer intento; le dedicamos una referencia propia: dimensión Z de las cubetas submicro.
5.4 Formatos de volumen (macro, semimicro, micro, submicro, capilar)
| Formato | Volumen de muestra | Cuándo usarlo |
|---|---|---|
| Macro | 2.5 – 4.5 mL | Muestra abundante, toda la altura del haz utilizable |
| Semimicro | 1.4 – 1.7 mL | Muestra limitada, aperturas enmascaradas |
| Micro | 250 – 1,000 µL | Muestras biológicas, reactivos caros |
| Submicro | 50 – 250 µL | Forense, lisado celular, muestras ultravaliosas |
| Capilar | 5 – 50 µL | Escala de nL donde no puede perder ni una gota |
En el trabajo con capilares, el paso de luz y el diámetro interno son la misma dimensión — elija con cuidado. Nuestro catálogo en stock incluye tubos capilares circulares, cuadrados y de geometría especial para estos volúmenes.
5.5 Aperturas, máscaras y bloqueo de luz dispersa
Las cubetas con máscara negra impiden que el haz pase por cualquier sitio que no sea la apertura óptica. Reducen los reflejos parásitos de las paredes de la cubeta y permiten medir microvolúmenes sin diluir en una cubeta macro. Para análisis de trazas por debajo de 0.05 unidades de absorbancia, una cubeta enmascarada puede bajar el suelo de ruido de la medición en un factor de dos o tres.
5.6 Cubetas de 2 ventanas frente a 4 ventanas
Una cubeta de 2 ventanas solo tiene pulidas las caras frontal y trasera, lo estándar para absorbancia. Una cubeta de 4 ventanas tiene las cuatro caras laterales ópticamente pulidas, lo que permite usar la misma cubeta para fluorescencia y absorbancia. Si una sola muestra necesita ambas mediciones (habitual en trabajo con nanopartículas y láseres de colorante), comprar una vez una cubeta de 4 ventanas sale más barato que cambiar de cubeta y emparejar pares después.
La regla del fabricante: si el catálogo estándar no tiene su geometría, paso de luz, altura de ventana o volumen, eso es un trabajo a medida, no un problema. Construimos de forma rutinaria cubetas no estándar para uso OEM y de investigación. Véase cubetas de cuarzo personalizadas y fabricación a medida de cubetas y celdas.
Sección 6
Aplicaciones por sector
Control de calidad farmacéutico y disolución
El UV-Vis es uno de los caballos de batalla del control de calidad farmacéutico. Los ingredientes farmacéuticos activos (API) se cuantifican directamente a partir de su absorbancia UV, los perfiles de disolución se miden en tiempo real y la uniformidad de contenido se verifica frente a métodos farmacopeicos (véase el capítulo general de la USP <857> para el procedimiento compendial de EE. UU. y los capítulos correspondientes de Ph. Eur. 2.2.25 y JP). Los laboratorios farmacéuticos suelen necesitar software conforme a 21 CFR Part 11 y espectrofotómetros validados frente a patrones NIST de óxido de holmio y didimio.
Ciencias de la vida: cuantificación de ADN, ARN y proteínas
Los ácidos nucleicos absorben a 260 nm; las proteínas absorben a 280 nm. La razón A260/A280 informa de la pureza: ~1.8 para ADN limpio, ~2.0 para ARN limpio, menos de 1.7 si hay contaminación por proteínas. La razón A260/A230 detecta contaminación por fenol, guanidina u otros arrastres de reactivo. Las cubetas de microvolumen y las celdas capilares son lo habitual aquí porque los volúmenes de muestra caen de forma rutinaria por debajo de 2 µL.
Análisis ambiental
El nitrato, el nitrito, el fosfato y los metales traza del agua potable se miden todos por UV-Vis, algunos directamente (el nitrato tiene una absorbancia UV a 220 nm), la mayoría mediante un reactivo colorimétrico (el metal forma un complejo coloreado y la cubeta contiene la solución coloreada). Las cubetas de paso largo (50 mm o 100 mm) son habituales en el trabajo de trazas, donde de otro modo la absorbancia cae por debajo del suelo de ruido.
Ciencia de materiales y nanotecnología
Las nanopartículas de oro y plata tienen una aguda resonancia de plasmón de superficie localizada en el rango visible que se desplaza con el tamaño, la forma y el estado de agregación de la partícula — el UV-Vis es como se confirma que una síntesis salió como se quería. Las mediciones de banda prohibida en semiconductores, la caracterización de láseres de colorante y la transmisión/reflexión de películas finas dependen todas del UV-Vis con el accesorio adecuado (esfera integradora para muestras difusas, accesorio de reflectancia para películas).
Alimentación, bebidas y cosmética
La medición del color, el contenido de vitaminas, el cribado de aditivos y la determinación del SPF de protectores solares viven todos en el UV-Vis. El ensayo de protectores solares, en particular, es una de las pocas aplicaciones que exige una transmisión UV amplia hasta 290 nm — las cubetas de cuarzo son obligatorias.
Sección 7
Resolución de problemas: cuando el espectro sale mal
Si su espectro sale mal, la causa casi siempre es una de cinco: luz dispersa, deriva de la línea base, un artefacto de la cubeta, desviación de Beer-Lambert o una calibración de longitud de onda incorrecta. Este es el flujo de diagnóstico práctico.
El árbol de resolución de problemas en cinco pasos
1
¿La absorbancia es sospechosamente alta, sobre todo por debajo de 220 nm? Sospeche de luz dispersa. Vuelva a hacer el blanco y luego use un filtro de corte conocido (p. ej. una solución de NaI o KCl según el ensayo de luz dispersa de ASTM E387); si la A medida es finita donde debería ser infinita, está superando su especificación de luz dispersa. Causas habituales: red rayada, óptica contaminada, ancho de rendija incorrecto.
2
¿La línea base deriva durante un barrido largo? El calentamiento de la lámpara es el primer culpable — las lámparas de deuterio necesitan 20–30 minutos para estabilizarse. Los cambios de temperatura en el compartimento de muestra son el segundo. Una cubeta rayada, con huellas o sucia es el tercero. Haga una línea base aire contra aire; si esa deriva, el problema es el instrumento.
3
¿Los números cambian al reorientar la cubeta? Eso es un artefacto de la cubeta. Los pares pulidos están emparejados cara frontal con cara trasera; gírelos 180° y cambia el camino óptico. Use siempre la cubeta en la misma orientación, con la cara pulida hacia el haz, y nunca la frote con papel abrasivo. En los pares emparejados, reemplace ambas cubetas juntas, nunca media pareja.
4
¿La curva de calibración se curva hacia abajo a A alta? Beer-Lambert deviation — you’re above the linear range. Either dilute the sample or move to a shorter path length (1 mm or 2 mm cell). If A > 2.0 también está peleando con la luz dispersa al mismo tiempo, lo que hace la curvatura más pronunciada. Use la calculadora de paso de luz para convertir sin rehacer la química.
5
¿λmax está desplazado más de ~1 nm de donde debería? Exactitud de longitud de onda. Use un patrón de óxido de holmio; los picos del Ho³⁺ a 241.15, 287.15, 361.50 y 536.30 nm son una verificación rápida (el NIST SRM 2034 documenta los valores certificados). Si están desplazados, el monocromador necesita recalibración. Esta es también la razón más común de que un espectro de referencia de un instrumento no se reproduzca en otro.
Problemas del lado de la cubeta y cómo detectarlos
Todo laboratorio de UV-Vis acaba culpando al instrumento de lo que en realidad es un problema de cubeta. Las señales: la absorbancia cambia al pasar a una cubeta nueva con el mismo tampón; una línea base plana en aire pero que deriva con la solución; un par desemparejado donde la cubeta «blanco» muestra absorbancia residual tras la limpieza. La solución es higiene (enjuague con el solvente adecuado, seque boca abajo, nunca con papel para lentes) y reemplazo (las cubetas envejecen, sobre todo tras exposición a ácido o solvente caliente).
Sección 8
Elegir el espectrofotómetro adecuado (y la cubeta que le corresponde)
Si está especificando un instrumento nuevo o un conjunto de accesorios, recorra esta lista de comprobación:
- Rango de longitud de onda — ¿necesita por debajo de 200 nm? ¿Por encima de 1100 nm? Eso decide el par de lámparas y el detector.
- Ancho de banda espectral / resolución — 2 nm basta para la mayoría del trabajo cuantitativo; 0.5–1 nm importa para bandas moleculares agudas e identificación farmacéutica.
- Especificación de luz dispersa — por debajo del 0.05% T a 220 nm es de grado de investigación; por debajo del 0.01% T es terreno de doble monocromador.
- Altura de haz (dimensión Z) — 8.5, 15 o 20 mm; esto dicta qué cubetas encajarán físicamente.
- Accesorios del compartimento de muestra — portacubetas termostatizado, torreta multicubeta, fibra óptica, esfera integradora, cubeta de flujo.
- Software / cumplimiento — el cumplimiento de 21 CFR Part 11 y Ph. Eur. y los registros de auditoría importan en laboratorios regulados.
Cuando el catálogo de cubetas estándar se queda corto
Las cubetas de catálogo sirven para el 80% de las mediciones. El 20% restante —pasos de luz no estándar (15 mm, 20 mm, 0.5 mm), aperturas inusuales, pedidos de volumen OEM o combinaciones de material/grado que nadie tiene en stock— es justo donde la fabricación a medida demuestra su valor. Construimos de forma rutinaria:
- Pasos de luz entre tamaños estándar (1.5 mm, 7 mm, 25 mm) para ventanas de Beer-Lambert concretas
- Dimensiones Z a medida para instrumentos no estándar y diseños OEM
- Cubetas de flujo con geometría de entrada/salida específica para monitorización de procesos en línea
- Conjuntos de materiales mixtos (ventanas de zafiro en un cuerpo de cuarzo para trabajo a alta T)
- Volúmenes OEM a granel con transmisión controlada entre lotes
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MachinedQuartz fabrica cubetas de cuarzo personalizadas a sus dimensiones exactas: pasos de luz no estándar, geometrías OEM, conjuntos de materiales mixtos. Sin pedido mínimo, plazo de entrega de 1–2 semanas.
Sección 9
UV-Vis frente a otras técnicas
Espectrofotómetro UV-Vis frente a espectrofotómetro solo visible
Un instrumento solo visible tiene únicamente una lámpara de tungsteno y cubre unos 320–1000 nm. Un instrumento UV-Vis añade una lámpara de deuterio y se extiende hasta 190 nm. Si necesita medir ADN, proteínas, protectores solares o cualquier compuesto aromático en el UV, necesita UV-Vis: el solo visible no puede hacer ese trabajo.
UV-Vis frente a espectroscopía IR / FTIR
El UV-Vis mide transiciones electrónicas en el rango de 190–780 nm. El IR/FTIR mide transiciones vibracionales en el rango de 2.5–25 µm (4000–400 cm⁻¹). El UV-Vis es mejor para la cuantificación; el IR/FTIR es mejor para la identificación estructural. Son complementarios, no competidores.
UV-Vis frente a espectroscopía de fluorescencia
El UV-Vis mide la luz que una muestra absorbe. La fluorescencia mide la luz que una muestra emite tras absorber luz UV-Vis. La fluorescencia suele ser 100–1000× más sensible, pero solo funciona con moléculas que fluorescen. Muchas celdas de fluorescencia son cubetas de 4 ventanas, de modo que la misma cubeta sirve para ambas mediciones — véase la guía de cubetas de fluorescencia para el proceso de selección completo.
UV-Vis frente a absorción atómica (AAS) e ICP
El UV-Vis mide moléculas en solución; la AAS y el ICP miden átomos individuales después de atomizar la muestra en una llama o un plasma. Para el análisis de metales a nivel de trazas, la AAS o el ICP-OES/MS superan al UV-Vis en sensibilidad por órdenes de magnitud. El UV-Vis sigue ganando cuando la matriz es compleja y un reactivo colorimétrico aporta selectividad.
UV-Vis frente a HPLC con detección por matriz de diodos
Un HPLC-DAD es un espectrofotómetro UV-Vis (el detector de matriz de diodos) situado detrás de una separación cromatográfica. Se aplican las mismas cuentas de Beer-Lambert. La diferencia es que el HPLC-DAD mide el espectro UV-Vis de cada componente después de tras la separación, de modo que los analitos que coabsorben no interfieren. El UV-Vis por sí solo es más rápido y barato; el HPLC-DAD es la respuesta cuando hay varios absorbentes que se solapan.
Sección 10
Preguntas frecuentes
¿Cuál es el principio de la espectrofotometría UV-Vis?
La espectrofotometría UV-Vis mide cuánta luz UV y visible absorbe una muestra en cada longitud de onda. Los fotones se absorben cuando su energía coincide con la diferencia de energía entre dos estados electrónicos del analito. El patrón de absorbancia identifica el compuesto, y el valor de absorbancia a una longitud de onda elegida se convierte en concentración mediante la ley de Beer-Lambert.
¿Por qué se usa cuarzo en las cubetas UV-Vis?
El cuarzo es transparente desde unos 190 nm hasta bien entrado el infrarrojo cercano. El vidrio óptico corta cerca de 340 nm y el plástico cerca de 380 nm, así que ninguno de los dos sirve en la región UV, donde absorben el ADN, las proteínas y los compuestos aromáticos. Para el trabajo en UV profundo por debajo de 200 nm, la opción correcta es el grado JGS1 totalmente sintético o el zafiro.
¿Cuál es la diferencia entre la espectrofotometría UV-Vis y la visible?
Un espectrofotómetro solo visible cubre aproximadamente de 320 a 1000 nm con una sola lámpara de tungsteno. Un instrumento UV-Vis añade una lámpara de deuterio y se extiende hasta 190 nm. El trabajo solo en UV, incluida la cuantificación de ácidos nucleicos y el ensayo de protectores solares, requiere la parte UV que los instrumentos solo visibles no alcanzan.
¿Qué significa la razón A260/A280?
La A260/A280 es una comprobación rápida de pureza para muestras de ácidos nucleicos. El ADN puro da una razón cercana a 1.8; el ARN puro, cercana a 2.0. Valores por debajo de 1.7 suelen indicar contaminación por proteínas, mientras que valores por encima de 2.1 pueden indicar contaminación por ARN en una preparación de ADN. La lectura debe tomarse en una cubeta de cuarzo limpia con una línea base de tampón estable.
¿Por qué la absorbancia debe mantenerse entre 0.2 y 1.0?
Por debajo de 0.2, el ruido del detector domina la señal. Por encima de 1.0, la luz dispersa, la no linealidad del detector y los efectos químicos (agregación, cambios de índice de refracción) alejan la curva de calibración de la linealidad de Beer-Lambert. Mantener A en la ventana de 0.2–1.0 da los valores de concentración más fiables sin repetir el experimento.
¿Se pueden usar cubetas de plástico para mediciones UV?
Las cubetas estándar de poliestireno y PMMA absorben con fuerza por debajo de 340 nm, así que no sirven para trabajo UV de verdad. Algunas cubetas de «plástico UV» afirman transmitir hasta 220 nm, pero su transmisión UV varía de lote a lote y fallan en solventes orgánicos. Para cualquier medición UV fiable, la opción correcta es una cubeta de cuarzo.
¿Cuál es la longitud de onda más baja que puede medir un espectrofotómetro UV-Vis?
Los instrumentos rutinarios llegan a 190 nm. Los de grado de investigación, con caminos ópticos purgados con nitrógeno y cubetas de cuarzo JGS1, pueden extenderse hasta unos 175 nm. Por debajo de 175 nm está la región del UV de vacío, que requiere óptica evacuada y ventanas de CaF₂ o LiF en lugar de cuarzo estándar.
¿Con qué frecuencia debe calibrarse un espectrofotómetro UV-Vis?
La exactitud de longitud de onda se verifica normalmente cada mes con un patrón de óxido de holmio, la exactitud fotométrica cada trimestre con filtros de densidad neutra y la luz dispersa una vez al año. Los laboratorios farmacéuticos siguen el calendario farmacopeico con una cualificación formal del rendimiento (PQ) al menos una vez al año. Tras sustituir la lámpara o un servicio técnico, ejecute el conjunto completo de comprobaciones antes de reanudar el trabajo.
Por qué puede confiar en esta página
AutorEquipo técnico de MachinedQuartz
Revisado porBryan Wright (fundador, más de 13 años en MQ)
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Última actualización30 de abril de 2026 · Próxima revisión: octubre de 2026
Contexto: Bryan fundó MachinedQuartz en 2013 tras trabajar con proveedores de óptica de cuarzo en el mercado estadounidense de equipos de laboratorio. Las notas prácticas sobre selección de cubetas, dimensión Z, grados de fabricación y artefactos de luz dispersa de esta guía proceden de la experiencia en planta de MQ y del historial de atención al cliente, no de un libro de texto. Cuando se hace referencia a normas de terceros, citamos directamente al NIST, la USP y Chemistry LibreTexts.
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